第115期層析分離，是否一定要評價柱效？

2019年01月23日source：管理員

? ? ?有人問到：“我的工藝是流穿模式，是否需要評價柱效？”還有人問到：“我的工藝是親和層析，單梯度洗脫，不用擔心拖尾，是否需要評價柱效？”今天，小編為大家進行統(tǒng)一解答。

什么是柱效？

? ? ?柱效（column efficiency），是指層析柱保留某一物質(zhì)而不使其擴散的能力。柱效越高，則分離度越高。

塔板理論及柱效評價標準

? ? ? 馬丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出塔板理論，將層析柱比作蒸餾塔，把一根層析柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間為固定相占據(jù)，另一部分空間充滿流動相。組分隨流動相進入層析柱后，就在兩相間進行分配。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達到分配平衡，這樣一個小段稱作一個理論塔板（theoretical plate）。經(jīng)過多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分先離開蒸餾塔，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。

理論塔板數(shù)（N）計算公式：

? ? ? 該公式中的Ve，必須從進樣時起算。

? ? ??每米理論塔板數(shù)（N/m）=理論塔板數(shù)（N） ÷ 柱床高度。

? ? ? HETP（height equivalent of theoretical plate），理論塔板等量高度，即每一層理論塔板的高度。

? ? ? 簡單來說，每米理論塔板數(shù)，是指每米有多少層；HETP，是指每一層有多高。可以說兩者是互為倒數(shù)的關(guān)系。

? ? ?評價標準：一般情況下，認為HETP ＜4倍粒徑大小即為比較理想的柱效。比如裝填平均粒徑90 μm的Sepharose填料，則要求HETP ＜360 μm，通過計算，要求每米理論塔板數(shù) ＞2778。或可根據(jù)實際情況，將柱效標準定為每米理論塔板數(shù) ≥3000。

對稱性，也稱峰不對稱因子（Asymmetry, As），用來評價層析柱裝填的均勻程度。

? ? ??As?=b/a。As ＞1，說明裝填偏松，表現(xiàn)為峰拖尾；As ＜1，說明裝填偏緊，表現(xiàn)為峰前沿。若對分離度有較高要求，可把標準定為0.8 ＜As ＜1.2；若對分離度要求并不高，可把標準定為0.8 ＜As ＜1.5，甚至更寬的范圍。

是否一定要評價柱效？

? ? ? 總體來說，還是建議進行柱效評價的，但柱效評價標準不能一概而論。

? ? ??高標準：1）分子篩層析；2）反相層析；3）疏水層析；4）采用階性梯度或線性梯度洗脫的離子交換層析。此類層析對分離度有較高要求，有些需要采用多梯度洗脫或線性洗脫，如果柱效不佳，往往會造成峰擴散或拖尾，會對純化效果產(chǎn)生很大影響。建議標準：HETP ＜4倍粒徑，0.8 ＜As ＜1.2。

? ? ? 低標準：1）親和層析；2）采用單梯度洗脫的離子交換層析。此類層析僅需采用單梯度洗脫，有時在產(chǎn)物洗脫下來后，還要立即進行稀釋，以防產(chǎn)物聚集，因此對分離度要求較低。然而，過于嚴重的峰擴散和拖尾，也是會影響純化效率的，因此柱效測定也必不可少。建議標準：HETP ＜5倍粒徑，0.8 ＜As ＜1.5。

? ? ? 僅要求峰型及對稱性：流穿模式。此類模式為目標產(chǎn)物流穿，雜質(zhì)被吸附，如果填料裝填不均勻，或者過于松散，仍會導致吸附不勻而影響載量和處理量。因此，評估柱效時建議觀察一下峰型及對稱性，如果峰型平滑，且對稱性良好，即可接受。建議標準：0.8 ＜As ＜1.5。當然，如果裝填工藝穩(wěn)定，甚至進行了工藝驗證，該模式也可以不進行柱效評價。

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柱效評價的常見問題及處理

前沿峰